行为学实验方法介绍

[BehaviorAtlas]

Y迷宫的行为学实验方法介绍

Y迷宫主要应用于动物的辨别性学习、工作记忆和参考记忆的测试，工作记忆主要指短期记忆，而参考记忆主要指长期记忆。Y迷宫实验相关的应用涉及了阿尔茨海默病、亨廷顿病、焦虑、抑郁症、智力障碍、精神疾病等领域。

01 实验装置

1. Y迷宫

Y迷宫一般是对称的封闭式 3 臂迷宫，其形状像大写的“Y”，各臂之间的夹角为 120°，每个臂都有一个可移动的门闸，用于限制实验动物的活动。3 个臂被随机设为：新异臂（novel arm）、起始臂（start arm）和其他臂（other arm）。

大鼠用 Y 迷宫臂长为 50 厘米，迷宫通道宽约 10 厘米，迷宫板壁高约 13 厘米；小鼠用 Y 迷宫臂长为 28 厘米，迷宫通道宽约 5 厘米，迷宫板壁高约 10 厘米。整个迷宫离地面高度约为 50 厘米，另外迷宫通常被涂成深色以防止动物在实验时出现焦虑。

2. 行为学信息采集系统

一湾生命科技团队基于深度学习算法开发的简便版小动物精细行为采集分析系统——BA-Lite软件，允许在无标记的情况下自动检测识别动物的12个身体点。用户通过人工绘制的方式对视频进行区域划分，系统进一步分析不同区域内小动物的进入时间、运动距离等参数，并生成多种数据图表，方便用户直观地观测动物的运动情况。

02 实验方法

实验前小Tips

啮齿动物往往对吃新食物很谨慎，因此，在正式实验之前，让实验动物熟悉实验所使用的食物奖励非常重要。食物奖励可以是固体食物（如加糖的麦片）或液体食物（如巧克力牛奶），进行药物测试的实验动物通常需使用液体食物作奖励，因为在某些药物的刺激下，吃固体食物可能会使实验动物出现不适。

1. 使用空间识别实验评估工作、参考记忆

[ 预实验 ]

适应阶段：

实验开始前，让动物熟悉实验人员，避免动物在实验过程中出现应激反应。

探索阶段：

封锁一个臂，把动物放置在起始臂且远离臂中间的位置，让动物在两个开放臂自由探索 3 分钟。

[ 正式实验 ]

在探索阶段结束 2 小时后进行。打开所有臂门闸，把动物放置在与探索阶段相同的位置上，让动物在三个臂自由探索 3 分钟。

[ 实验数据 ]

（1）记录每个臂的进臂次数，每个臂的滞留时间及总路程；

（2）记忆损害者在新异臂的探索时间和路程会有所缩短。

[ 注意事项 ]

（1）每天对同一只实验动物重复实验操作 1 次，持续进行 5-7 天；

（2）每次实验后要尽可能去除上一只动物的气味。

2. 使用自发连续交替选择实验评估工作记忆

[ 预实验 ]

实验开始前，让动物熟悉实验人员，避免动物在实验过程中出现应激反应。

[ 正式实验 ]

关闭起始臂门闸，将实验动物放在起始臂 10 秒，打开起始臂门闸并开始计时，让实验动物随机选择一个臂，可以是新异臂或者其他臂。动物四肢全部进入一个臂后即可关闭门闸，实验动物在臂上停留的时间限制为 30 秒。待实验动物吃完食物奖励后，结束计时， 将动物放回起始臂，进行下一轮实验。若实验动物 2 分钟内没有进入任何臂，则记录实验失败，将实验动物取出放回，随后又进行下一轮实验。

[ 实验数据 ]

（1）记录实验动物每次进入的臂；

（2）记录从起始臂进入其他两臂所需的时间，主要用于判断动物对此实验的积极性；

（3）动物连续进入不同臂 N次（N≥3），记为 N-2 次成功；

（4）根据 成功次数/最大成功次数 可计算出动物实验交替率，动物实验交替率可以判断动物自发连续交替选择的程度，百分比越高，说明动物工作记忆能力越强。

[ 注意事项 ]

（1）自发连续交替选择实验基于迷宫的新颖性，实验动物无需提前熟悉环境；

（2）自发连续交替选择实验为连续性实验，一只动物实验完成后再开展另一只动物的实验；

（3）每天可对同一只实验动物重复实验操作 10 次，每次实验时间不超过 2 分钟，实验天数不超过 10 天。

3. 使用奖赏交替选择实验评估参考记忆

[ 预实验 ]

适应阶段：

将实验动物放置在起始臂上，迷宫里随机放置一些食物，让实验动物自由探索迷宫3分钟。实验动物自由探索迷宫四次，每次至少间隔十分钟，适应期通常持续1到2天。

强迫阶段：

在适应阶段后进行。将实验动物放置在起始臂上，随机关闭一只臂，在开放臂放置食物奖励，诱导实验动物探索。通过改变闭合的臂来重复该训练，每个臂进行相同数量的训练，直至实验动物熟悉任务为止。

[ 正式实验 ]

（1）随机在新异臂或其他臂放置食物奖励，关闭无食物奖励的臂门闸，强迫实验动物从起始臂进入放置着食物奖励的臂；

（2）获得食物奖励后立即将实验动物移回起始臂（总时间应小于 5 秒），限制活动 10 秒；

（3）同时开放新异臂和其他臂，实验动物随机选择，待其四肢都进入一个臂视为一次选择，结束一次实验：

① 若实验动物选择进入过的臂，则无食物奖励，限制活动 10 秒，记录为一次错误选择；

② 若实验动物选择未进入过的臂，则给予少量食物奖励，记录为一次正确选择。

[ 实验数据 ]

（1）记录起始臂滞留时间，主要用于判断动物对此实验的积极性；

（2）记录正确选择次数、错误选择次数，根据数据计算出每天的平均正确率；

（3）平均正确率升的越快，说明动物参考记忆能力越强。

[ 注意事项 ]

（1）实验前动物需要限食，动物体重降低至实验前 85%-90% 后方可进行实验；

（2）实验动物需提前熟悉迷宫环境，以减少探索初始阶段在新空间中的焦虑；

（3）每天可对同一只实验动物重复实验操作 10 次，每次实验时间不超过 2 分钟，实验天数不超过 10 天。

[BehaviorAtlas]

BehaviorAtlas 3D精细行为学应用范式：旷场试验

旷场试验(Open field test)是由美国心理学家Calvin S. Hall开发的一项实验测试，用于检测动物（通常是啮齿动物）的运动活动水平、焦虑和探索意愿等。啮齿类动物天生厌恶开阔的场地，因为开阔的场地会使它们暴露在捕食者面前。但是，它们也想探索新的领域，这样的“矛盾”使得我们能够研究它们的焦虑水平，以及运动和探索能力。

旷场实验使用的装置，我们可以简单地理解为一个“空盒子”，可以根据实验设计的不同来对“空盒子”进行修饰，例如透明的、不透明的等等。

在实验中我们往往需要记录动物的各类数据，比如运动速度、距离以及在中间和边缘区域的时间和次数等等。记录的方式有很多，从早前的人为手工记录，到后来随着信息技术的发展，利用摄像头硬件和软件实现了自动化记录和评估，大大提高了实验效率和客观性。然而，实现了自动化，如何才能更加智能化呢？

三维精细行为分析系统，是国内首家无标记(Markerless)三维动物捕捉设备，无需在动物身上添加任何物理标记，就能精准的识别动物身体的多个（>16）部位，追踪三维骨骼序列。

01 实验装置

三维精细行为分析系统(BehaviorAtlas)包括了硬件设备和软件应用，硬件设备包括了旷场实验箱、设备箱体、图像采集相机、控制主机、主显示屏、定标显示器以及灯光控制器组成。软件应用有数据处理软件(BA-Analyzer)和数据分析软件(BA-Explorer)。

图1 BehaviorAtlas系统实物图

BehaviorAtlas系统可使用的实验箱体

• 形状类型：正方形、长方形、圆形。
• 底壁颜色：可以是白色、黑色、棕色、透明、非透明。
• 箱底底部：尽量保持实验箱底部颜色与实验动物的颜色不同（为了在深度学习网络训练时，能够更准确地识别动物）。
• 底壁材质：有机玻璃、丙烯酸、丙烯酸塑料、木质、金属等。

02

图像采集相机配置

• 默认使用帧率为30帧/秒的摄像头（可定制化高帧率相机），摄像头为4个。
• 支持红外摄像头，实现黑暗视野下记录。如果您有更高的要求，我们可为您进行定制化。

02 实验流程

相机标定(Calibration)：

关闭柜门和灯光后，打开软件，按定标软件提示的7个步骤完成0号相机的单独定标和0-1，0-2，0-3三对相机的两两定标。

数据采集(Data collection)：

相机标定完成后，放置好旷场箱体和实验动物，在软件中记录组名、样本标号、实验信息等，点击按钮开始录像，每次录像生成4个不同视角的视频。

三维重建(3D reconstruction)：

在处理软件中载入视频数据，软件采用深度学习技术自动追踪动物并进行三维重建，同时得到已分类的多种动作序列，例如站立、跳跃、小跑、梳理毛发等。

数据分析(Data Analysis)：

载入处理好的数据，可查看单样本、多样本、分组样本的视图，包括的图标有速度-轨迹热图、位置热图、各种参数对应的箱型图、动作序列图等等。

图2 BehaviorAtlas系统采集视频界面

图3 三维骨架重建后的动物身体骨架及运动轨迹：一只在方形旷场“跑圈刷步数”的小鼠（数据来源：复旦大学脑转化院舒友生实验室）

03 分析指标

三维精细行为分析系统(BehaviorAtlas)采集到的旷场试验数据如下图所示：

*上图仅为示意图，请以实际情况为准

01 总路程

动物在旷场中运动的总路程，处于中间和边缘区域的运动距离等；（中间和边缘区域的界定可根据您实验设计而定，并非固定）。

02 运动速度

动物身体点运动速度、总体运动速度，处于中间和边缘区域的运动速度、实验中前n分钟、后m分钟等运动速度等等。

03 运动强度

动物身体点运动强度、总体运动强度，处于中间和边缘区域的运动强度、实验中前n分钟、后m分钟等运动强度等等。

04 身体高度

动物身体高度在整个实验中的变化趋势。

05 身体长度

动物身体长度在整个实验中的变化趋势。

06 身体角度

动物身体角度在整个实验中的变化趋势。

07 静止时间

人为设定不动阈值进行计算动物静止的时间、次数等。

08 进出次数和时间

动物进出中间和边缘区域的次数，在中间和边缘区域的时间和比值等。

09 直立次数

人为设定直立时长的阈值为一次直立，进行计算直立次数。

10 跳跃次数

人为设定跳跃时长或高度的阈值为一次跳跃，进行计算跳跃次数。

11 动作占比

动物在实验中表现的各类动作总时长和比值等。

12 左右肢差异

分析左右肢运动差异，反应动物身体协调性。

13 行为序列

得到行为序列图谱，组间行为差异化分析。

04 影响因素

小鼠相关因素

实验前动物的饲养环境、动物性别、动物背景、是否伴随应激（饮水及食物剥夺）及昼夜节律等。

实验装置相关因素

旷场的形状、体积、实验持续时长、数据采集方式（摄像系统的类别）等。

05 注意事项

1.在采集数据时，应做好相机标定，否则影响三维重建效果。

2.在同一实验的不同阶段，如果移动了实验箱体，尽量将箱体保持同一位置。

3.实验箱底部的颜色尽量保持与实验动物的颜色不同，方便软件更好的识别动物。

4.旷场实验环境应隔音，光强度、温度和湿度适宜且保持一致。

5.动物在24h内有其活动周期，故每次实验应选择在同一时间段内完成。

6.两次实验之间清洗实验设备，以免上次动物余留气味、粪便影响下次实验结果。

7.同一批实验应由同一实验者操作，使用同样的方式抓取小鼠，动作轻柔。

8.实验动物提前运送到行为学实验室专用临时笼架，适应环境3小时右，减少动物紧张。

9.在行为学测试中通常采用多种实验方法综合分析评估动物的某一个行为变化，而旷场实验对小鼠各方面影响较小。为了减少实验之间的相互影响，可优先安排动物进行旷场实验。

参考资料
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Denenberg VH (July 1969). “Open-field bheavior in the rat: what does it mean?”. Annals of the New York Academy of Sciences. 159 (3): 852–9. doi:10.1111/j.1749-6632.1969.tb12983.x. PMID 5260302.

[BehaviorAtlas]

动物行为学实验之高架十字迷宫

高架十字迷宫(EPM)是以动物自发恐惧反应的一种非条件反应模型，雏形是K. C. Montgomery 在1955年所创立的，他使用高架Y迷宫观察了啮齿动物的恐惧和焦虑诱发行为，值得注意的是该高架Y迷宫的一个选择臂是被包围的，另一个选择臂是开放的。这些对恐惧诱导的行为和探索的观察在1984年被Handley和Mithani改编成ElevatedPlus迷宫，他们测试了受试者在受到恐惧刺激的迷宫探索实验时，α-肾上腺素受体激动剂和拮抗剂对受试者行为的影响。

高架十字迷宫既可建立焦虑应激的模型，也是国际上公认的经典测量焦虑症状的方法。该模型已被广泛应用于新药开发/筛选/评价、药理学、毒理学、预防医学、神经生物学、动物心理学及行为生物学等多个学科，尤其是大鼠和小鼠等啮齿类动物焦虑抑郁研究的经典实验。

01 实验装置

1 迷宫组件

高架十字迷宫中央有一个小型平台，四周有两条相对开放臂和两条相对闭合臂。闭合臂被大约40厘米高的板子包围，顶部通常无遮挡，对于开放臂则需凸起边缘（约1厘米）来确保受试者在探索时不会从开放的臂上掉下去。开放臂和闭合臂彼此成90度角放置，通常长30至50厘米，宽约5至10厘米，设备的尺寸可以根据所使用的对象（小鼠，大鼠或小型灵长类动物）而有所不同。设备地板应与受试者的颜色形成对比，整个设备需被抬高到地面以上至少50厘米的高度。

2 行为学信息采集系统

一湾生命科技团队基于深度学习算法开发的简便版小动物精细行为采集分析系统——BA-Lite软件，允许在无标记的情况下自动检测识别动物的12个身体点。用户通过人工绘制的方式对视频进行区域划分，系统进一步分析不同区域内小动物的进入时间、进入次数、运动距离等参数，并生成多种数据图表，方便用户直观地观测动物的运动情况。

02 实验流程

1. 将实验动物提前运送到行为学实验室专用临时笼架 ，适应环境至少3h左右， 减少动物紧张。每次实验之前必须彻底清洁设备，以避免残留刺激的影响。

2. 实验开始时，将实验动物头朝开臂背向实验者放入迷宫中央区域，同时开启BA-Lite软件收集5min内实验动物进入开放臂和闭合臂的次数以及在每个臂上花费的时间等数据。

3. 实验结束后将受试动物放入饲养笼，做好实验已完成的动物的标记信息，同时做好设备的清洁。

03 指标分析

1. 实验动物移动距离、头部下垂、梳理次数

2. 实验动物在开放臂、闭合臂的进入次数及停留时间

3. 实验动物进入开放臂的次数占比、实验动物进入开放臂停留时间占比

高架十字迷宫主要用于评估焦虑和焦虑相关疾病。在该测试下观察受试者对开放空间的偏好，并将治疗组或疾病组的表现与对照组进行比较。进入开放臂次数及停留时间与实验动物的焦虑情绪成负相关，进入开放臂次数越少，停留时间越短，说明小鼠的焦虑情绪越严重。

04 注意事项

1. 尽量在每天同一时间段进行实验，以减少数据的波动；

2. 为了提高实验动物入臂次数，避免实验动物总是躲在闭合臂，通常在测试前先将实验动物放在开阔场地适应5min之后再放入迷宫；

3. 为避免迷宫中的阴影，高架迷宫应从上方充分照明，适当的照明还可以确保拍摄对象可以看到食物奖励或其他提示；

4. 实验时，实验者需根据实验动物的性别和雌性发情周期阶段的不同而相应地设计高架十字迷宫实验；

5. 实验时不建议实验者在场，特别是啮齿类动物具有较强的探索欲望，实验者的存在可能会对实验数据造成一定的影响；

6. 实验室需保持实验环境安静，切勿出现突发且尖锐的声音，此时动物容易出现惊吓症状而呈冻结状态，影响实验进程，降低结果准确性

[BehaviorAtlas]

动物行为学实验之三箱社交

我们生活的社会是由各种错综复杂的人际关系组成的网络，社交在日常生活中必不可少。如果神经发育发生障碍、正常的社会行为和社会认知被破坏，就会出现自闭症、精神分裂症，双相情感障碍、抑郁症等精神类的疾病。因此，利用适当的动物模型进行社会行为方面的研究对于社会精神病理学的研究和治疗是至关重要的。

三箱社交(Three-chamber Sociability)是一种被广泛使用的测试，是Crawley 2004年开发的作为一种调查自闭症谱系障碍模型中社交能力和新社交偏好的新方法。后来，越来越多的科研工作者都运用三箱社交来研究神经精神障碍和转基因啮齿动物模型。三箱社交是将人类神经精神障碍导致的社会缺陷转化为成功的动物模型的有效工具，有助于研究和调查社会缺陷，并开发有效的治疗方法。

01 实验装置

三箱装置

该设备是一个尺寸为（60cm40cm22cm）的矩形，使用可移动隔板分为三个腔室。每个隔板之间有中间通道（4cm*4cm）使三个腔室相通，以允许实验动物在室内自由移动。中央腔室用作起始区域，而左右两腔室用于容纳刺激对象。左右两个腔室中央需各放一个规格一致的足够容纳实验动物的笼子，这些笼子允许实验动物和刺激物之间相互作用，并有助于限制攻击性互动。设备的壁可以是透明的或不透明的，可以根据实验的要求而变化。

行为学信息采集系统

一湾生命科技团队基于深度学习算法开发的简便版小动物精细行为采集分析系统——BA-Lite软件，允许在无标记的情况下自动检测识别动物的12个身体点。用户通过人工绘制的方式对视频进行区域划分，系统进一步分析不同区域内小动物的进入时间、运动距离等参数，并生成多种数据图表，方便用户直观地观测动物的运动情况。

02 实验流程

社交预实验

首先将实验动物放置在三箱设备中，打开所有分隔门，让受试者探索熟悉设备（包含左右两腔室及空笼子）约5至10分钟。当受试者探索完整个装置之后把它放回中央室，并把左右两腔室的门关闭。此时可允许受试者再次探索中央室5到10分钟。

为了避免受试者与刺激对象有激烈的互动，让刺激对象在实验过程中保持冷静，在正式测试前24小时，也要使刺激对象熟悉并习惯于左右两腔室及笼子。

社交能力评估

预实验结束后，将受试者引入中央腔室并让其适应设备。然后将刺激对象随机放置在左右两腔室其中的一个笼子里，同时让侧室的门保持关闭，另外一个侧腔室的空笼子则让其处于非刺激状态。值得注意的是，刺激室中的刺激对象和非刺激室可随机改变。最后打开左右两腔室的门，让受试者探索设备，受试者探索10分钟后即可结束实验。

在实验过程中，为了避免对实验动物造成影响，实验者需从测试区域外观察记录实验数据。采用简便版小动物精细行为采集分析系统——BA-Lite软件观察实验，可让系统自动跟踪和记录测试对象在设备内的活动，无需手动记录。

新社交偏好评估

社交能力评估后，立即将受试者放回中央腔室，关闭左右两腔室的门。将第二个刺激对象放置于先前的空笼子中。现在左右两腔室包含一个已经相互作用的刺激对象和一个新的不熟悉的刺激对象。放置第二个刺激对象后，打开分隔门，让受试者进行10分钟的探索实验。

03 实验数据分析

收集三个腔室中受试者进入每个小室的时间、进入小室的次数以及每个笼子的嗅闻时间等数据。

❖若受试者有明显的社交倾向，则与有动物的笼子的交互时间会比空笼子的交互时间长；

❖若受试者有强烈的好奇心，在新旧动物之间，会与新动物的交互时间更长。

04 注意事项

实验需在具有优化照明的消音室中进行；

若使用自动化设备，需要确保受试者和刺激对象熟悉门的自动打开和关闭；

在每只动物进行实验后，需要彻底清洁设备，避免上一只动物的气味影响实验结果；

实验的持续时间往往很长，每个测试对象可以跨越大约40分钟。由于实验需要实时刺激来测试社交能力和新社交偏好，因此需要使用大量的动物样本。

参考文献：
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Crawley JN. Designing mouse behavioral tasks relevant to autistic-like behaviors. Ment Retard Dev Disabil Res Rev. 2004;10(4):248-58. doi: 10.1002/mrdd.20039. PMID: 15666335.