2025 年 5 月 4 日，中山三院戎利民教授团队通过 BehaviorAtlas AI 小鼠运动功能分析系统等技术的运动功能分析发现敲除 Trem2 的小鼠脊髓损伤后运动功能恢复更佳，结合多种技术验证阐明其机制为：敲除 Trem2 可促进 TFEB 核转位，增强小胶质细胞溶酶体膜通透化介导的自噬活性，推动脊髓损伤的功能与组织学恢复。一湾生命科技BehaviorAtlas AI 小鼠运动功能分析系统为本论文中的步态行为学分析提供了强有力的技术支持！
脊髓损伤（spinal cord injury, SCI） 是一种常导致严重残疾的神经系统疾病，其病理生理过程分为原发性和继发性损伤，原发性损伤为直接机械性损伤；继发性损伤发生于原发性损伤后，伴随大量小胶质细胞死亡。继发性损伤中的小胶质细胞死亡是加重损伤的关键因素，而保护小胶质细胞、调控其功能是脊髓损伤治疗的重要策略之一。TREM2 作为中枢神经系统疾病中的关键免疫信号分子，在小胶质细胞中高表达并调控其多种功能，但其在脊髓损伤中的作用及机制尚未明确。团队对现有单细胞测序数据的分析显示，Trem2 与溶酶体通路密切相关，因此本研究聚焦于此展开探索。
溶酶体膜通透化（Lysosomal membrane permeabilization, LMP）指溶酶体膜完整性被破坏，进而降低溶酶体活性并造成细胞损伤。而自噬是依赖溶酶体的分解代谢通路，维持细胞内稳态并提高细胞存活率。已有文献证实 LMP 在小胶质细胞中同样发挥重要作用。因此，抑制 LMP 对维持细胞功能至关重要，但目前脊髓损伤研究中小胶质细胞 LMP 的研究相对匮乏，其上游调控分子未知。
2025 年 5 月 4 日，中山大学附属第三医院戎利民教授团队在 Cell Proliferation 上在线发表了题为 “TREM2 Impedes Recovery After Spinal Cord Injury by Regulating Microglial Lysosomal Membrane Permeabilization-Mediated Autophagy” 的研究论文，该研究通过构建 Trem2 基因敲除小鼠模型，通过运动诱发电位（Motor evoked potential, MEP）评估、Basso 小鼠运动（Basso Mouse Scale, BMS）评分、BehaviorAtlas 3D 步态分析等实验发现，Trem2 敲除小鼠在脊髓损伤后表现出更好的功能恢复。 研究深入探究机制，通过单细胞测序、透射电镜、免疫荧光、蛋白质印迹等技术，并利用溶酶体膜通透化诱导剂 NDI 进行正反验证，证实了敲除 Trem2 可通过促进 TFEB 核转位增强溶酶体生物发生，修复溶酶体膜通透性，提升溶酶体活性并增加自噬活性。而自噬水平的提升能在体内挽救更多小胶质细胞，并促进脊髓损伤后的功能与组织学恢复。 该研究深化了对 TREM2 调控溶酶体膜通透性变化的理解，为脊髓损伤的干预治疗提供了新的潜在治疗靶点和病理生理机制。
01 表型筛选：锁定 Trem2 与小胶质细胞溶酶体、自噬通路的研究方向
1.1 脊髓损伤后溶酶体功能变化或与小胶质细胞的数量、形态及聚集相关
研究对现有单细胞测序数据的分析显示：脊髓损伤后损伤部位细胞组成比例发生显著变化，小胶质细胞在损伤后 7 天成为优势细胞类型，其比例达到峰值（图 1A,B）。结果表明小胶质细胞在脊髓损伤反应中起着至关重要的作用。 研究通过特异性免疫荧光染色技术进一步探讨小胶质细胞的变化，结果显示：与假手术组相比，脊髓损伤后小胶质细胞密度和形态存在显著差异；损伤中心小胶质细胞稀疏且形态不规则，提示大量细胞死亡；相反损伤周围小胶质细胞密度显著增加、体积增大；远离损伤中心的区域则与假手术组无明显差异（图 1C）。
研究将小胶质细胞聚类为 11 个簇，分析了它们在脊髓损伤不同阶段的 t-SNE 图（图 1D）。细胞比例折线图结果显示，簇 1 和簇 4 在损伤前后发生显著变化：假手术组以簇 4 为主要表达类型，损伤后 7 天以簇 1 为主要表达类型（图 1E）。热图结果显示，簇 1 主要表达 Igf1、Pf4、Ctsb、Ctsd、Cd68 ，簇 4 主要表达 Dleu2、Ccdc152、Gpr183、P2ry12、Gls （图 1F）。通过对特异性标记物做免疫荧光实验，结果表明，簇 4 主要在未损伤状态下表达，而簇 1 在损伤后高表达。而差异基因的 KEGG 和 GO 分析显示，与簇 4 相比，簇 1 的溶酶体、自噬及膜相关通路活性显著增强，提示这些通路在脊髓损伤修复中发挥关键作用（图 1G,H）。这些结果表明，自噬和溶酶体相关途径在脊髓损伤后发生显著变化，在修复机制中起着至关重要的作用。
1.2 脊髓损伤后 Trem2 表达升高，且与溶酶体膜通透化相关基因关联
此外，研究对 Trem2 敲除小鼠的小胶质细胞形态分析显示，其分形维数降低，分支状表型减少，但启动型和反应型表型增加，这些结果提示 TREM2 缺失会导致小胶质细胞形态复杂性降低，呈现活化表型。先前文献报道发现，小胶质细胞形态变化可能与溶酶体功能相关，溶酶体膜通透性对溶酶体的活性有重要影响，而改善溶酶体膜通透性被认为是治疗脊髓损伤的有效方法。研究进一步分析发现，脊髓损伤后 Trem2 表达升高，且与 Cd68、Ctsd、Ctsb、Ctsz 等溶酶体膜通透化相关基因表达呈显著正相关。
单细胞测序和免疫荧光结果显示，Trem2 在脊髓损伤后 7 天表达达到峰值，且主要表达于 Iba1（小胶质细胞 / 巨噬细胞）中，在损伤边界的荧光强度最高（图 2A-E）。进一步研究脊髓损伤后溶酶体标志物 Lamp1 的分布发现，Lamp1 同样在损伤边界高表达，其分布模式与 TREM2 高度一致（图 2F,G）。这些结果提示了损伤边界的小胶质细胞溶酶体活性最高，且可能受 TREM2 调控。
02 体内功能验证：实验证实敲除 TREM2 可促进脊髓损伤后恢复
为评估创伤性脊髓损伤后 Trem2 敲除小鼠的功能改善，研究进行了运动诱发电位（Motor evoked potential, MEP）评估、Basso 小鼠运动（Basso Mouse Scale, BMS）评分、BehaviorAtlas 3D 步态分析。功能学检测结果显示，与 Wt 小鼠相比，Trem2⁻/⁻ 小鼠脊髓损伤后 35 天的运动诱发电位振幅更高（图 3A,B），BMS 评分从损伤后 7 天开始显著优于 Wt 小鼠（图 3C）。BehaviorAtlas 3D 步态分析通过创建步态的 3D 模型，分析后肢运动学指标发现，Trem2⁻/⁻ 组表现出更好的步态表现；步态周期指标显示，Trem2⁻/⁻ 组的站立相更短、摆动相更长（图 3D-J）。这些结果表明 Trem2⁻/⁻ 小鼠在脊髓损伤后表现出更好的功能恢复。
03 机制挖掘：溶酶体膜通透化修复是 TREM2 调控脊髓损伤恢复的核心机制
3.1 单细胞测序提示敲除 Trem2 通过调控自噬和溶酶体通路促进脊髓损伤恢复
研究对 Wt 和 Trem2⁻/⁻ 小鼠脊髓损伤前后的样本进行单细胞测序（图 4A,B）。差异基因分析显示，Trem2 敲除后溶酶体酶相关基因（Ctsz、Ctsb、Ctsd、Ctse ）显著下调（图 4C）。GO/KEGG 分析显示，Trem2⁻/⁻ 小鼠的自噬、溶酶体及膜相关通路显著激活（图 4D）；GSEA 分析进一步证实，Trem2⁻/⁻ 小鼠的自噬和溶酶体通路活性显著高于 Wt 小鼠（图 4F,G）。
3.2 体外验证沉默 Trem2 通过增强 TFEB 核转位改善溶酶体膜通透化
为了验证上述单细胞测序的结果，研究进行了体外实验。首先研究构建了 3 个 Trem2 小干扰 RNA（siRNA），通过实验筛选出沉默效果最佳的 siRNA-2 用于沉默 BV2 细胞中的 Trem2 表达。随后利用 LLOMe 诱导 BV2 小胶质细胞溶酶体膜通透化，结果显示，沉默 Trem2 可显著减少溶酶体蛋白酶 CTSL 的泄漏，恢复 CTSL 与溶酶体标志物 LAMP1 的共定位，同时显著降低溶酶体膜通透化标志物半乳糖凝集素 3（Galectin‐3 , Gal3）点表达（图 5A-G）。这些结果表明了 Trem2 沉默可修复溶酶体膜通透性。
先前文献表明 TREM2 与 Syk 的磷酸化有关，研究提出这一机制可能与沉默 Trem2 后溶酶体膜通透性的改善有关，研究通过 TFEB 免疫荧光实验和 Western blot 实验进一步证实。结果显示，沉默 Trem2 后，BV2 细胞细胞核中 TFEB 表达增加，细胞质中 p-Syk 和 TFEB 表达降低（图 5H-N）。已知 TFEB 核转位与溶酶体生物发生密切相关，可进一步修复溶酶体膜通透化，因此这些结果提示沉默 Trem2 可以减少 Syk 磷酸化，从而增强其核易位，最终改善溶酶体膜通透性。
3.3体外沉默 Trem2 可增强 BV2 小胶质细胞的自噬活性
此外，研究还通过 Western blot 分析和免疫荧光技术，探讨了沉默 Trem2 能否通过改善溶酶体膜通透性提升自噬活性。 Western blot 结果显示，CQ 作为自噬抑制剂处理组比起对照组，自噬标记物 LC3II 和 自噬底物 P62 的表达均显著升高，证实了 CQ 对自噬的有效阻断。利用 LLOMe 诱导 BV2 小胶质细胞溶酶体膜通透化，结果显示，沉默 Trem2 会出现 LC3II 表达显著增加和 P62 表达显著降低的特征性变化，且 CQ 处理后 LC3II 进一步升高、P62 回升（图 6A-C）。**这些结果表明，沉默 Trem2 可显著促进自噬过程，是通过增加自噬流而非阻断的方式增强细胞的自噬活性。**免疫荧光结果显示， LLOMe 诱导后，沉默 Trem2 会出现 LC3B 表达增加，P62 表达降低的变化，且 加入 NDI 处理后，LC3B 表达下降、P62 回升（图 6D-I）。这些发现表明，体外沉默 Trem2 可通过恢复溶酶体膜通透性来增强自噬活性。
3.4 体内敲除 Trem2 可修复脊髓损伤后的溶酶体膜通透化
免疫荧光结果显示，与 Wt 小鼠相比，Trem2⁻/⁻ 小鼠脊髓损伤后 7 天，小胶质细胞内的 CTSL 分布更集中，泄漏面积显著减少（图 7A,B）。**这表明敲除 Trem2 可有效地修复脊髓损伤后溶酶体膜的通透性。**亚细胞分离结合 Western blot 显示，Trem2⁻/⁻ 小鼠细胞质中溶酶体蛋白酶（CTSL、CTSD、CTSC）表达更低，溶酶体组分中上述蛋白酶表达更高（图 7C-F）；ELISA 结果显示，Trem2⁻/⁻ 小鼠细胞质中 CTSD 活性降低，溶酶体中 CTSD 活性升高，总活性无显著差异。这些发现表明，敲除 Trem2 并非减少溶酶体酶分泌，而是通过降低溶酶体膜通透性减少其向细胞质的泄漏。 而透射电镜结果显示，Wt 小鼠小胶质细胞的溶酶体更小，溶酶体膜通透化更明显，而 Trem2⁻/⁻ 小鼠的溶酶体膜完整性更好（图 7G,H）。这一发现表明敲除 Trem2 有助于改善溶酶体膜的通透性。
3.5 体内敲除 Trem2 通过修复溶酶体膜通透化促进脊髓损伤后的自噬
上述单细胞测序结果提示敲除 Trem2 可能改善溶酶体膜通透性并促进自噬。研究通过透射电镜发现，Trem2⁻/⁻ 小鼠小胶质细胞中的自噬溶酶体数量显著多于 Wt 小鼠，而 NDI 处理后该效应被逆转（图 8A,B）。Western blot 结果显示 Trem2⁻/⁻ 小鼠脊髓损伤后 P62 表达降低，关键自噬蛋白 Beclin-1 和 LC3II 表达显著升高（图 8C,D）；qPCR 结果显示其 P62 mRNA 水平升高，提示 P62 转录活跃且降解加快（图 8E）。最后通过免疫荧光结果进一步证实，Trem2⁻/⁻ 小鼠的自噬标志物 LC3B 荧光强度显著高于 Wt 小鼠（图 8F,G）。这些结果证实了敲除 Trem2 通过降低溶酶体膜通透性显著增强脊髓损伤后的自噬活性。
3.6敲除 Trem2 通过改善组织病理学特征促进脊髓损伤修复
研究证实了敲除 Trem2 通过改善溶酶体膜通透性和增加自噬溶酶体的产生来促进自噬。最后，研究进一步探讨了位于脊髓损伤中心和周围的更多小胶质细胞是否可以存活。免疫荧光结果显示，与 Wt 小鼠相比，Trem2⁻/⁻ 小鼠脊髓损伤部位的小胶质细胞数量和密度显著增加，而 BrdU 染色显示两组小胶质细胞增殖无显著差异，提示小胶质细胞数量增加源于自噬介导的细胞存活提升，而非增殖增加（图 9A-C）。大体解剖和组织染色结果显示，Trem2⁻/⁻ 小鼠的损伤面积更小，胶质瘢痕区域缩小，胶原沉积减少，神经元尼氏阳性面积更大；免疫荧光显示其 GFAP（星形胶质细胞 / 胶质瘢痕标志物）阳性面积更小，MAP2（神经元细胞体和树突）的综合密度也更高（图 9D-I）。综上所述，研究结果表明敲除 Trem2 可挽救更多小胶质细胞，并通过改善组织学结果促进脊髓损伤后的恢复。
04 总结
本研究通过全身敲除 Trem2 深入探究了其在脊髓损伤中的作用及机制，采用体内表型验证 - 体外机制探究 - 正反实验验证的经典论证思路，逻辑严密。研究证实，敲除 Trem2 可通过降低 Syk 磷酸化促进 TFEB 核转位，修复溶酶体膜、增强自噬并挽救更多小胶质细胞，从而改善脊髓损伤后的功能恢复。 该研究结果为通过 Trem2 编辑改善脊髓损伤提供了理论支持和新的研究方向，同时为溶酶体相关中枢神经系统疾病的临床治疗提供了潜在的新治疗靶点。
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参考文献：
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Zhao T, Di J, Kang Y, et al. TREM2 Impedes Recovery After Spinal Cord Injury by Regulating Microglial Lysosomal Membrane Permeabilization-Mediated Autophagy. Cell Prolif . 2025;58(10):e70047. doi:10.1111/cpr.70047