缺血性脑卒中急性期治疗长期面临再灌注时间窗狭窄的挑战，目前仅有少部分患者能够接受有效的溶栓或血管内治疗。因此，如何在急性期保护缺血脑组织、减少神经元死亡并促进功能恢复，成为脑卒中研究的重要方向。
近日，复旦大学附属华山医院吴毅、袁鹏、余克威团队在 CNS Neuroscience & Therapeutics 发表研究，通过小鼠大脑中动脉闭塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）模型，结合转录组学、蛋白组学、分子生物学及多维度行为学评估，系统揭示了连续 Theta 爆发刺激（continuous theta burst stimulation，cTBS）在脑缺血急性期发挥神经保护作用的分子机制。
研究发现，cTBS 能够通过抑制钙调神经磷酸酶（calcineurin）表达，激活 AKT/FOXO1 信号通路，降低 FasL 介导的神经元外源性凋亡，从而减少梗死周边区神经元死亡并改善运动功能。
该研究为急性期脑缺血提供了一种非侵入性神经调控治疗的新思路，也进一步拓展了经颅磁刺激（TMS）在脑卒中神经保护领域的应用价值。
脑卒中（Stroke）是全球范围内致残率和死亡率最高的神经系统疾病之一，其中缺血性脑卒中约占全部脑卒中的 85% 以上。
尽管近年来血管再通治疗取得了显著进展，但大量患者仍会因急性期神经元持续死亡、炎症反应以及脑组织损伤扩展，最终遗留不同程度的运动障碍和神经功能缺损。
因此，在缺血损伤早期抑制神经元死亡、保护梗死周围区域功能，是促进脑卒中恢复的重要研究方向。
连续 θ 爆发刺激（Continuous Theta Burst Stimulation，cTBS）是一种新型经颅磁刺激模式，具有无创、安全、操作便捷等优势，近年来逐渐应用于脑卒中康复研究。
然而，cTBS 如何在分子层面发挥神经保护作用，目前仍缺乏系统性解释。
2026 年 7 月 8 日，复旦大学附属华山医院吴毅、袁鹏、余克威团队在 CNS Neuroscience & Therapeutics 发表研究，系统解析了 cTBS 改善急性脑卒中神经损伤的作用机制。
研究表明，脑缺血后 Ca²⁺ 信号异常激活促进 Calcineurin 上调，进一步抑制 AKT/FOXO1 信号通路，导致 FasL 介导的外源性凋亡增强；而 cTBS 能够逆转这一过程，通过抑制 Calcineurin、激活 AKT/FOXO1 通路，保护梗死周围神经元并促进功能恢复。
01
cTBS 显著改善脑卒中后小鼠的运动功能及自主探索能力
为了评价 cTBS 对脑卒中后神经功能恢复的影响，研究人员首先建立急性缺血性脑卒中小鼠模型。
实验动物分为三组：
-
正常组（Con）： 未进行脑缺血处理的小鼠。
-
MCAO 模型组（MCAO）： 建立大脑中动脉闭塞模型的小鼠。
-
cTBS 治疗组（cTBS）： MCAO 后接受连续 Theta 爆发刺激治疗的小鼠。
术后 3 小时开始每日给予 cTBS 或假刺激，连续治疗 7 天，并分别于术后第 1、3、7 天进行多维度行为学评估（图 1A）。
生存率分析显示，cTBS 组 7 天生存率显著高于 MCAO 对照组（p=0.017），同时 cTBS 显著减轻了脑卒中诱导的体重下降（图 1B-C）。
TTC 染色结果显示，cTBS 组梗死体积明显小于 MCAO 组（p<0.001）（图 1D），提示 cTBS 能够有效减少缺血造成的脑组织损伤。
在神经功能评价方面，术后第 7 天：
- cTBS 组 mNSS 神经功能缺损评分显著降低（p<0.001）；
- 转棒实验中跌落潜伏期显著延长（p<0.0001）；
- 网格抓握实验中抓握时间明显增加（p<0.01）。
上述结果表明，cTBS 能够改善脑卒中后的运动能力、肌力和平衡协调功能。
进一步的旷场实验显示，cTBS 组小鼠在术后第 3 天和第 7 天均表现出更加活跃的运动轨迹，自主探索行为明显恢复，整体活动状态更接近正常水平（图 1H）。
CatWalk 步态分析进一步显示，cTBS 能够改善 MCAO 小鼠对侧肢体运动能力及步态协调性（图 1I-J）。
综上，cTBS 不仅能够减少脑组织损伤，还能够显著改善脑卒中后的运动协调能力和自主探索行为，为进一步解析其神经保护机制奠定基础。
02
多组学联合分析揭示 Ca²⁺ 信号及神经元凋亡是 cTBS 发挥神经保护作用的重要靶点
为了进一步解析 cTBS 发挥神经保护作用的分子机制，研究团队对 MCAO 小鼠梗死周围区域开展了转录组测序（RNA-seq）和蛋白质组学联合分析（图 2A）。
差异表达分析显示，cTBS 干预后，大量与神经损伤、细胞死亡以及信号转导相关的基因和蛋白表达发生显著变化。
进一步通过 GO 功能富集分析发现，差异基因主要涉及：
- 神经元死亡调控；
- 细胞凋亡过程；
- 炎症反应调节；
- 细胞信号转导等多个生物学过程。
KEGG 通路分析进一步显示，Ca²⁺ 信号通路、PI3K/AKT 信号通路以及细胞凋亡相关通路均显著富集（图 2D-E）。
随后，研究人员利用基因集富集分析（GSEA）进一步验证发现，与 MCAO 模型组相比，cTBS 治疗后：
- Ca²⁺ 信号相关基因集合活性明显下降；
- 凋亡相关基因集合整体受到抑制。
这一结果提示，Ca²⁺ 信号异常激活可能处于 cTBS 神经保护机制的上游位置。
与此同时，蛋白互作网络（PPI）分析发现，FasL 位于多个凋亡相关网络的核心节点，是连接上游信号变化与神经元死亡的重要分子。
时间序列分析进一步显示，脑缺血后凋亡相关基因随着损伤时间延长逐渐升高，而 cTBS 连续治疗 7 天能够明显逆转这一变化趋势（图 2N）。
综合上述结果，研究团队提出：
脑卒中急性期 Ca²⁺ 信号异常激活以及 FasL 介导的外源性凋亡，是导致梗死周围神经元持续死亡的重要原因；而 cTBS 能够通过调控相关信号通路，抑制这一病理过程。
03
cTBS 抑制 FasL 介导的外源性神经元凋亡
在明确凋亡可能是 cTBS 神经保护作用的重要机制后，研究人员进一步检测了外源性凋亡通路相关蛋白的表达变化。
Western Blot 结果显示，脑卒中发生后：
- FasL 表达显著升高；
- Caspase-8 活化增强；
- Cleaved Caspase-3 水平明显增加。
而经过 cTBS 治疗后，上述凋亡相关蛋白表达均显著降低（图 3A-D）。
进一步免疫荧光分析显示，在梗死周围区域，FasL 主要定位于神经元内；接受 cTBS 治疗后，神经元 FasL 表达水平明显下降（图 3E）。
TUNEL 染色结果进一步证实：
MCAO 模型组存在大量神经元凋亡，而 cTBS 干预后，TUNEL 阳性细胞数量显著减少，提示神经元死亡受到有效抑制（图 3F-G）。
此外，FasL 免疫荧光定量分析显示，cTBS 组神经元 FasL 表达显著降低（p<0.001）（图 3H-I）。
为了进一步验证 AKT/FOXO1 信号通路在其中的作用，研究人员加入 AKT 特异性抑制剂 MK-2206 进行干预。
结果发现：
- MK-2206 能够阻断 cTBS 对 p-AKT 和 p-FOXO1 的促进作用；
- 逆转 cTBS 对 FasL 表达的抑制效果；
- 消除 cTBS 对神经元凋亡的保护作用（图 3J-O）。
这些结果说明，cTBS 能够通过激活 AKT/FOXO1 信号通路，下调 FasL 表达，阻断外源性凋亡级联反应，从而提高梗死周围神经元存活率。
04
AKT/FOXO1 信号通路介导 cTBS 抑制神经元凋亡
为了进一步明确 FasL 表达受哪些上游信号调控，研究团队重点分析了 PI3K/AKT/FOXO1 信号通路在 cTBS 神经保护过程中的作用。
Western Blot 检测结果显示，脑缺血发生后，AKT 及 FOXO1 的磷酸化水平明显下降，提示该保护性信号通路受到抑制。而接受 cTBS 治疗后，p-AKT 和 p-FOXO1 水平均显著恢复（图 4A-D）。
进一步免疫荧光实验显示，FOXO1 在神经元中的表达定位发生明显改变，且 cTBS 能够促进 FOXO1 活化状态恢复，与蛋白检测结果一致（图 4E）。
为了验证 AKT 信号是否为 cTBS 发挥作用的关键环节，研究人员进一步采用 AKT 特异性抑制剂 MK-2206 进行干预。
结果发现：
- AKT 活性受到抑制后，cTBS 对 p-AKT 和 p-FOXO1 的促进作用明显减弱；
- cTBS 对 FasL 表达的抑制效果被部分逆转；
- 神经元凋亡保护作用明显下降。
这些结果表明，AKT 信号激活是 cTBS 抑制神经元死亡的重要机制。
综合来看，cTBS 能够通过恢复 AKT/FOXO1 信号通路活性，下调 FasL 表达，从而减少外源性凋亡发生，保护缺血半暗带区域神经元。
05
Ca²⁺ 信号位于 AKT/FOXO1 信号通路上游
前期多组学分析提示，Ca²⁺ 信号可能是调控 cTBS 神经保护作用的重要上游因素。
为了验证这一假设，研究人员利用 AAV 病毒工具，对神经元 Ca²⁺ 活性进行增强或抑制，并进一步观察其对 cTBS 治疗效果的影响。
实验分组包括：
- Con 组： 正常对照组；
- MCAO 组： 脑缺血模型组；
- cTBS 组： cTBS 治疗组；
- hM4Di 组： 抑制神经元活动组；
- cTBS+hM3Dq 组： 增强神经元 Ca²⁺ 活性组。
结果显示，当神经元 Ca²⁺ 信号被增强后，即使接受 cTBS 治疗：
- 脑梗死面积缩小作用明显减弱；
- 组织病理损伤改善效果下降；
- 神经元凋亡减少作用受到抑制（图 5B-E）。
进一步分子检测发现，增强 Ca²⁺ 信号后：
- AKT 及 FOXO1 磷酸化水平再次降低；
- FasL、Caspase-8 和 Cleaved Caspase-3 表达重新升高（图 5F-Q）。
此外，ChIP-qPCR 实验证实：
FOXO1 可以直接结合 FasL 启动子区域，并调节 FasL 转录表达；而 Ca²⁺ 信号能够影响这一调控过程（图 5J、K、P）。
因此，研究结果进一步证明：
Ca²⁺ 信号位于 AKT/FOXO1 信号通路上游，是决定缺血后神经元是否进入凋亡程序的重要调控节点。
06
Calcineurin 连接 Ca²⁺ 信号与 AKT/FOXO1 通路，是 cTBS 发挥神经保护作用的重要枢纽
在明确 Ca²⁺ 信号位于 cTBS 作用机制上游后，研究团队进一步寻找连接 Ca²⁺ 信号与 AKT/FOXO1 通路之间的关键调控分子。
研究发现，钙调神经磷酸酶（Calcineurin） 作为一种 Ca²⁺ 依赖性蛋白磷酸酶，在脑缺血后的病理过程中发挥重要作用。
首先，研究人员检测了 MCAO 小鼠梗死周围区域中 Calcineurin 的表达变化。
结果显示：
- 脑卒中发生后，Calcineurin 表达水平显著升高；
- 连续 Theta 爆发刺激（cTBS）治疗能够明显降低 Calcineurin 表达。
进一步实验中，研究人员利用 AAV 病毒介导神经元中特异性敲低 Calcineurin。
结果发现，即使不接受 cTBS 治疗，Calcineurin 敲低后的小鼠也表现出：
- 脑梗死面积明显缩小；
- 脑组织病理损伤减轻；
- 神经元存活率提高。
分子机制分析显示，Calcineurin 敲低能够：
- 增强 AKT 和 FOXO1 磷酸化水平；
- 降低 FasL、Caspase-8 和 Cleaved Caspase-3 表达；
- 减少梗死周围区域神经元凋亡。
这些结果表明，Calcineurin 并非单纯伴随脑缺血变化，而是直接参与调控神经元死亡过程。
综合上述结果，研究团队提出完整作用模型：
脑卒中发生后，Ca²⁺ 信号异常激活，诱导 Calcineurin 持续高表达，进一步抑制 AKT/FOXO1 信号通路，使 FasL 表达升高并促进外源性神经元凋亡；而 cTBS 能够通过抑制 Calcineurin，重新激活 AKT/FOXO1 通路，降低 FasL 介导的凋亡反应，最终减少神经元死亡并促进功能恢复。
07
总结
本研究系统解析了连续 Theta 爆发刺激（cTBS）改善急性缺血性脑卒中的分子机制。
研究发现，脑缺血发生后，Ca²⁺ 信号异常激活促进 Calcineurin 表达升高，进一步抑制 AKT/FOXO1 信号通路，使 FasL 介导的外源性凋亡增强，最终导致梗死周围区域神经元持续死亡。
而 cTBS 能够通过：
- 抑制 Calcineurin 表达；
- 恢复 AKT/FOXO1 信号活性；
- 降低 FasL 介导的凋亡反应；
减少神经元损伤，缩小脑梗死范围，并改善小鼠运动功能和自主探索能力。
该研究不仅进一步完善了经颅磁刺激促进脑卒中恢复的理论基础，也提示 Calcineurin 可能成为未来急性脑卒中神经保护治疗的重要干预靶点。
同时，该研究证明了多维度行为学评价在神经保护研究中的重要价值。通过旷场、自主探索、转棒、网格抓握以及 CatWalk 步态分析等行为学指标，研究人员能够更加全面地评估治疗策略对神经功能恢复的影响。
这一研究为急性脑缺血阶段的非侵入性神经调控治疗提供了新的理论依据，也为未来精准化脑卒中康复策略的发展提供了重要方向。
08
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参考文献：
Yang P, Qin H, Zhou B, et al. The Protective Mechanism of Continuous Theta Burst Stimulation in the Acute Phase of Stroke Through Modulation of the Calcineurin/AKT/FOXO1 Signaling Pathway. CNS Neurosci Ther. Published online July 8, 2026. doi.org/10.1002/cns.71017